要使 ELISA試劑盒 測定得到精確的成果，不論是定性的仍是定量的，必須嚴(yán)格按照規(guī)定的辦法制備試劑和施行測定。主要試劑的制備關(guān)鍵已如前述，其他一般性試劑，如包被緩沖液、洗刷液、標(biāo)本稀釋液、結(jié)合物稀釋液、底物工作液和酶反響停止液等，制造時(shí)不行掉以輕心。
(一)加樣
在ELISA試劑盒中除了包被外，一般需進(jìn)行45加樣。在定性測定中有時(shí)不強(qiáng)調(diào)加樣量的精確性，例如規(guī)定為加樣一滴。此刻應(yīng)該運(yùn)用相同口徑的滴管，保持精確的加樣姿勢，使每滴液體的體積基本相同。在定量測定中則加樣量應(yīng)力求精確。標(biāo)本和結(jié)合物的稀釋液應(yīng)按規(guī)定制造。加樣時(shí)應(yīng)將液體加在孔底，防止加在孔壁上部，并留意不行出現(xiàn)氣泡。
(二)比色
如陰性對照色彩極淺，在定性測定中一般可采用目視比色。如用比色計(jì)測定成果，精確性決議于ELISA板底的平坦與透明度和比色計(jì)的質(zhì)量。
(三)洗刷
洗刷在ELISA試劑盒過程中不是反響聚，但卻是決議試驗(yàn)成敗的關(guān)鍵。洗刷的意圖是洗去反響液中沒有與固相抗原或抗體結(jié)合的物質(zhì)以及在反響過程中非特異性吸附于固相載體的攪擾物質(zhì)。聚苯乙烯待塑料對蛋白質(zhì)的吸附效果是普遍性的。因此在ELISA試劑盒測定的反響過程中應(yīng)盡量防止非特異性吸附，而在洗刷時(shí)又應(yīng)把這種非特異性吸附的攪擾物質(zhì)洗刷下來。在標(biāo)本和結(jié)合物的稀釋液和洗刷液中參加聚山梨酯一類物質(zhì)即右達(dá)到此意圖。聚山梨酯是聚氧乙烯去水山梨醇脂肪酸酯，為非離子型的表面張力物質(zhì)，常作為助溶劑。依據(jù)脂肪酸的品種而對聚山梨酯編號，結(jié)合月桂酸的為聚山梨酯20，在ELISA中zui為常用。它的洗刷效果好，并具有減少非特異性吸附和增強(qiáng)抗原抗體結(jié)合的效果。
洗刷如不*，特別在zui后一次，如有酶結(jié)合物的非特異性吸附，將使空白值升高。另外，在間接法中如血清標(biāo)本內(nèi)的非特異性IgG吸附在固相上而未被洗凈，也將與酶標(biāo)抗體效果而產(chǎn)生攪擾。
ELISA板的洗刷一般可采用以下辦法：①吸干孔內(nèi)反響液;②將洗刷液注滿板孔;③放置2min，略作搖擺;④吸干孔內(nèi)液，也可傾去液體后在吸水紙上拍干。洗刷的次數(shù)一般為3～4次，有時(shí)甚至需洗5～6次。
(四)保溫
在ELISA試劑盒中一般有二次抗原抗體反響，即加標(biāo)本后和加結(jié)合物后，此刻反響的溫度和時(shí)刻應(yīng)按規(guī)定的要求，保溫容器是水浴箱，可使溫度迅速平衡。各ELISA板不該疊在一同。為防止蒸發(fā)，板上應(yīng)加蓋，或?qū)迤椒旁诘撞繅|有濕紗布的濕盒中。濕盒應(yīng)該是金屬的，傳熱容易。如用保溫箱，空濕盒應(yīng)預(yù)先放在其中，以平衡溫度，這在室溫較低時(shí)更為重要。參加底物后，反響的時(shí)刻和溫度通常不做嚴(yán)格要求。如室溫高于20℃，ELISA板可避光放在試驗(yàn)臺上，以便不時(shí)調(diào)查，待對照管顯色適其時(shí)，即可停止酶反響。
