要使ELISA試劑盒測(cè)定得到的作用，不論是定性的仍是定量的，有必要嚴(yán)峻依照規(guī)矩的方法制備試劑和施行測(cè)定。
首要試劑的制備要害已如前述，其他一般性試劑，如包被緩沖液、洗刷液、標(biāo)本稀釋液、結(jié)合物稀釋液、底物工作液和酶反應(yīng)中止液等，制作時(shí)不可漫不經(jīng)心。
緩沖液可于冰箱中短期保存，運(yùn)用前應(yīng)查詢是否蛻變。蒸餾水的質(zhì)量在ELISA中也至關(guān)重要，運(yùn)用新鮮重蒸餾的。不合格的蒸餾水可使空白值升高。
測(cè)定的施行中，應(yīng)力求各個(gè)過(guò)程操作的標(biāo)準(zhǔn)化，下面以板式ELISA為例，介紹有關(guān)留心事項(xiàng)。
（一）ELISA實(shí)驗(yàn)加樣
在ELISA中除了包被外，一般需進(jìn)行45加樣。在定性測(cè)定中有時(shí)不強(qiáng)調(diào)加樣量的性，例如規(guī)矩為加樣一滴。此刻應(yīng)該運(yùn)用相同口徑的滴管，堅(jiān)持的加樣姿勢(shì)，使每滴液體的體積底子相同。在定量測(cè)定中則加樣量應(yīng)力求。
標(biāo)本和結(jié)合物的稀釋液應(yīng)按規(guī)矩制作。加樣時(shí)應(yīng)將液體加在孔底，防止加在孔壁上部，并留心不可出現(xiàn)氣泡。
（二）ELISA實(shí)驗(yàn)保溫
在ELISA中一般有二次抗原抗體反應(yīng)，即加標(biāo)本后和加結(jié)合物后，此刻反應(yīng)的溫度和時(shí)刻應(yīng)按規(guī)矩的要求，保溫容器是水浴箱，可使溫度迅速平衡。各ELISA板不該疊在一同。為防止蒸發(fā)，板上應(yīng)加蓋，或?qū)迤椒旁诘撞繅|有濕紗布的濕盒中。
濕盒應(yīng)該是金屬的，傳熱簡(jiǎn)略。如用保溫箱，空濕盒應(yīng)預(yù)先放在其間，以平衡溫度，這在室溫較低時(shí)更為重要。參與底物后，反應(yīng)的時(shí)刻和溫度一般不做嚴(yán)峻要求。如室溫高于20℃，ELISA板可避光放在實(shí)驗(yàn)臺(tái)上，以便不時(shí)查詢，待對(duì)看管顯色適當(dāng)時(shí)，即可中止酶反應(yīng)。
（三）ELISA實(shí)驗(yàn)洗刷
洗刷在ELISA過(guò)程中不是反應(yīng)聚，但卻是決定實(shí)驗(yàn)成敗的要害。洗刷的目的是洗去反應(yīng)液中沒(méi)有與固相抗原或抗體結(jié)合的物質(zhì)以及在反應(yīng)過(guò)程中非特異性吸附于固相載體的煩擾物質(zhì)。聚苯乙烯待塑料對(duì)蛋白質(zhì)的吸附作用是普遍性的。
因此在ELISA測(cè)定的反應(yīng)過(guò)程中應(yīng)盡量防止非特異性吸附，而在洗刷時(shí)又應(yīng)把這種非特異性吸附的煩擾物質(zhì)洗刷下來(lái)。在標(biāo)本和結(jié)合物的稀釋液和洗刷液中參與聚山梨酯（吐溫，Tween）一類物質(zhì)即右到達(dá)此目的。
聚山梨酯是聚氧乙烯去水山梨醇脂肪酸酯，為非離子型的表面張力物質(zhì)，常作為助溶劑。依據(jù)脂肪酸的品種而對(duì)聚山梨酯編號(hào)，結(jié)合月桂酸的為聚山梨酯20，在ELISA中zui為常用。它的洗刷作用好，并具有削減非特異性吸附和增強(qiáng)抗原抗體結(jié)合的作用。
洗刷如不*，特別在zui后一次，如有酶結(jié)合物的非特異性吸附，將使空白值升高。其他，在間接法中如血清標(biāo)本內(nèi)的非特異性IgG吸附在固相上而未被洗凈，也將與酶標(biāo)抗體作用而發(fā)作煩擾。
ELISA板的洗刷一般可采用以下方法：①吸干孔內(nèi)反應(yīng)液；②將洗刷液注滿板孔；③放置2min，略作搖擺；④吸干孔內(nèi)液，也可傾去液體后在吸水紙上拍干。洗刷的次數(shù)一般為3～4次，有時(shí)甚至需洗5～6次。
（四）ELISA實(shí)驗(yàn)比色
如陰性對(duì)照色彩極淺，在定性測(cè)定中一般可采用目視比色。如用比色計(jì)測(cè)定作用，性決定于ELISA板底的平坦與透明度和比色計(jì)的質(zhì)量。
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